Nació el 6 de noviembre de 1479. Segunda hija de los Reyes Católicos, fue educada por Beatriz Galindo, 'la Latina'. En el año 1496 se casó con archiduque Felipe (el Hermoso), primogénito de Maximiliano de Austria y de María de Borgoña, para así fortalecer la política internacional de su padre. Recibió malos tratos de Felipe, eso con las continuas ausencias y constantes infidelidades influyeron en el comportamiento de la Reina.

Tras la muerte de sus hermanos Juan e Isabel, y su sobrino Miguel de Portugal en 1500, pasó a ser heredera de Castilla y Aragón. A pesar de que estaban claros sus problemas de enajenación mental y a las tendencias francesas de su marido, su madre Isabel la nombró heredera en su testamento, aunque especificó que en caso de ausencia o incapacidad administrase el reino Fernando el Católico hasta la mayoría de edad de su nieto Carlos, el futuro Carlos I. Juana y su marido fueron reconocidos como herederos por las Cortes de Castilla y de Aragón.

En 1504 falleció Isabel, y Fernando tenía esperanzas de conservar el gobierno en nombre de su hija, pero la actitud de una parte de la nobleza castellana, que se acercó a Felipe, le obligó a retirarse a Aragón.

Felipe el Hermoso, murió por beber un vaso de agua helada después de jugar a pelota. Tenía 28 años, cinco hijos y otro en camino. "Llegada a Miraflores, descendió a la fosa sepulcral donde había sido depositado el cuerpo de su buen esposo, y después de haber permanecido allí durante todo el funeral, hizo subir el féretro y abrirlo, primero la caja de plomo, y luego la de madera, y desgarró los sudarios embalsamados que envolvían el cadáver. Y hecho esto, púsose a besar los pies de su esposo". Bastó el deseo de Felipe de ser enterrado en Granada para que la Reina de Castilla iniciara un peregrinaje con el féretro que duró tres años (1506-1509). La acentuación del desequilibrio de Juana hicieron que Fernando asumiera de nuevo el gobierno de Castilla en 1506. Cuando murió, su nieto Carlos se hizo dar el título de rey, aunque Juana siguió siendo reina y en los documentos su nombre figuraba en primer lugar. Por lo demás la reina permaneció, hasta su muerte, alejada de toda actividad política en su residencia de Tordesillas. Su cuerpo descansó en la cripta del convento hasta 1574, momento en el que su nieto, Felipe II, lo trasladó primero a El Escorial y después a Granada.

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